作业帮如从植物中分离叶绿体,应如何操作?与分离线粒体有何不同?
来源：学生作业帮助网 编辑：作业帮 时间：2024/05/08 13:12:09
如从植物中分离叶绿体,应如何操作?与分离线粒体有何不同?
如从植物中分离叶绿体,应如何操作?与分离线粒体有何不同?
如从植物中分离叶绿体,应如何操作?与分离线粒体有何不同?
分离叶绿体应在等渗溶液（0.35mol/L NaCl+0.01mol/L tris缓冲液）中制备,用等渗溶液将叶子研磨然后通过离心的方法将叶绿体分离出来（整个过程应在0—5oC下进行）.
方法步骤
（1）最好在晴天上午10时左右选取生长正常的菠菜叶子（菜心、白菜、豌豆也可）洗干净,用吸水纸擦干,去柄及粗脉,称5克叶子.
（2）将叶子剪碎放在研钵中,加10m1 0.35mol/L NaCl、1ml 0.01mol/Ltris HCl缓冲液及少量的石英砂,研磨成匀浆.
（3）把匀浆倒在二层沙布中过滤.
（4）取滤液在约1000rpm（每分钟的转速）的速度离心2分钟,弃沉淀,要上清液.
（5）上清液在3000rpm离心5分钟,弃上清液,沉淀即是叶绿体.
（6）将沉淀（叶绿体）加入0.35mol/L NaCl溶液5ml,即为叶绿体悬液.
从细胞中分离线粒体有一个基本步骤：即先制备组织或细胞匀浆,然后进行差速离心,如有必要还可以进行密度梯度离心.组织细胞的特异性及所要线粒体的实验用途决定了方法的细节.这些细节包括：匀浆器的选择、缓冲液的成分、许可混杂其他细胞器的程度等.线粒体的分离在技术上来说要求不是很高,但想要成功分离它们,要先了解所采用的组织、细胞的性质,有时还要作预实验.以下几点适用于大多数方法：
1,所有步骤在摄氏0～4度进行.
2,操作要快,线粒体的纯度只要达到实验要求即可,因为每一步的操作都会带来损失.
3,多次少量制备的总得率要大于一次大量制备的得率.
4,操作过程中保持细胞和细胞器悬液为稀释状态,从而减少其沉淀和黏结的可能性.
5,所使用的溶液要能保持线粒体的完整,易于分级操作,而且不影响以后的操作.
6,比较典型的用以分离线粒体的溶液包括：保持匀浆的确pH缓冲液、螯合剂、保持细胞器渗透张力的糖分.在细胞组分分级分离过程中几乎无一例外的使用了等渗的蔗糖溶液（0.25mol/L),但对于制备线粒体,甘露糖具有更大的优势.缓冲液成分的确定最终依赖于用于分离线粒体的原料的性质.
7,制备匀浆是线粒体分离的关键步骤,其目的是在不破坏亚细胞器组分的前提下破碎细胞,如果分离线粒体出现问题,首先要检查这一步.
8,分离线粒体时可能混杂其他细胞器,线粒体的相对纯度可以通过检测线粒体和其他可能存在的细胞器的标志酶来确定.检测标志酶时要考虑到它们在整个匀浆中相对含量的高低.以下是经常用到的标志酶：
线粒体：细胞色素c氧化酶、琥珀酸脱氢酶
溶酶体：酸性磷酸酶、β-半乳糖苷酶
过氧化物酶体：过氧化氢酶、尿酸酶
oh my god!田田。。。是你吗。。。。